本文原文发表于Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 201 (2021), 114092. Author: Yuling Zhang, Pei Qi.如需原文，请与我们联系。
摘要
游离巯基是蛋白质类产品（包括单克隆抗体）的一个重要特性。本文使用一种新技术，即可变技术（），来量化单克隆抗体（mAbs）中游离巯基的数量，并且用到著名的Ellman试剂。简言之，蛋白质（包括单抗）的未结合硫醇（游离巯基）与Ellman试剂反应，产生2-硝基-5-硫苯甲酸盐（TNB2−），它可以在412 nm的可见波长下检测到并能进行量化。该方法不需要对稀进行释，操作简单，可重复，花费时间不到一个小时。将新方法得到的值与传统紫外或荧光方法的文献值进行了比较。本实验室已经使用该验证方法两年，所有支持数据表明，该方法分析变异性小，且中间精度的相对标准差（RSD）≤10%，定量限制（LOQ）为0.1 mol/mol，这足以使它成为一个很好的方法来测量蛋白质（单抗）中的游离巯基的含量。
简介
游离硫基含量是单抗等蛋白质类物质的一个重要特性，重要性在于巯基产生的二硫键可使蛋白质适当折叠，以形成蛋白质的高级结构。在单克隆抗体的生产过程中，偶尔会观察到LC或LC上的自由轻链（LC）、自由重链（HC），如HL、HH、HHL或自由巯基，这些会影响产品的质量和稳定性。因此，快速响应并精确测量自由巯基的含量，对巯基早期工艺开发和后期生产监控都至关重要。另外也很重要是，目前有报道指出，铜等金属可以影响游离巯基的含量以及二硫键的稳定性。
自从Ellman报道了5,5’-二硫-二（2-硝基苯甲酸）（DNTB，后被命名为Ellman试剂，用来检测游离巯基）试剂以来，有许多文章在pH、变性条件和螯合剂方面改进了埃尔曼试剂的反应参数。还有其他标记试剂，如4,4-二噻代二吡啶（4-DPS）和荧光标记剂，如5-碘乙酰胺荧光素（5-IAF）或N-（1-吡啶）马来酰亚胺（NPM）。HPLC和UPLC已经被用作分离工具来支持对紫外线或荧光探测器的定量。最近，质谱法被用来表征含有游离巯基的位点。传统的紫外检测方法或荧光检测方法和HPLC/UPLC方法不仅需要与游离巯基进行反应，而且还需要使用半胱氨酸或谷胱甘肽去校准标准曲线。利用高效液相色谱/（HPLC/UPLC）技术进行测量时，通常需要稀释试验样品。这种情况下，测试一个样品，除了需要一个控制和空白之外，通常还需要五点校准，这是非常耗时的，由于这些巯基反应物的稳定性有限，它代表了潜在的变化来源。此外，HPLC或UPLC方法除了对柱子的调节外，还要为每次进样增加约15 min的分离时间。因此，这种方法的分析时间很长，需要几个小时才能完成。同样值得注意的是，荧光检测方法所需的一系列测试样品的稀释，可以增加更多的变异性。
最近，一种使用SoloVPE仪器（可变光程技术）的紫外技术可用于测定蛋白质含量，并被证明有效地测量蛋白质从0.01 Au到450 Au（或0.01 mg/mL到300 mg/mL）的吸光度，不要求任何稀释。在本文中，据知是首次使用SoloVPE从已知浓度的DNTB定制缓冲液来确定消光系数（ɛ），然后应用该消光系数ɛ来确定未知样品中的游离巯基的含量，不需测量校准曲线，也没有样品稀释的要求。这种简化的过程提高了日常实验和制备冷冻缓冲试剂的准确性和精度，测量5个样品仅需要约一个小时。这些优点可以被用来蛋白质浓度或吐温80储存液浓度的实时检测。
SoloVPE法测定游离巯基的原理
众所周知，传统的紫外-可见分光光度计使用1 cm比色杯作为固定光路长度，检测器在约2 Au（吸光度/cm，Abs/cm）处达到饱和。与传统的紫外-可见光谱法不同，SoloVPE采用了一种基于光谱法的先进技术，来快速收集可变光程长度下的线性吸光度数据，由此确定以Abs/mm为单位的斜率值和回归系数（R2）。不需要手动稀释，也不需要校准。SoloVPE从低至0.005 mm的路径长度读取读数，并可以测量高浓度蛋白质样品，而无需进一步稀释或空白背景校正。事实上，测试样品浓度可以高达200倍于使用1厘米比色皿的传统测量方法，而且吸光度可以高达450 Au（Abs/cm）。
这里我们把SoloVPE用于游离巯基的测量。当半胱氨酸、BSA或单抗与DNTB反应时，会生成2-硝基-5-硫代苯甲酸酯（TNB2−），该物质在412 nm处产生吸收。它的化学结构反应示意图如Fig. 1所示。反应混合物的紫外-可见光谱包括DNTB、TNB2−, 半胱氨酸或蛋白质是由SoloVPE在Fig. 2所示的不同光程下通过快速测量模式收集的。光谱显示，从190−600 nm有两个特征峰，分别是280 nm - 330 nm之间，和400-430 nm之间。280 nm处的峰是由含有色氨酸或酪氨酸的氨基酸或DNTB或TNB2-的芳香苯环形成的。330 nm处的顶点和412 nm处的肩部的吸光度来自反应物TNB2−。因此，这两种波长在文献中都被用于检测。然而，由于330 nm太接近280 nm的色氨酸吸光度，因此优选412 nm。当蛋白质浓度较高时，会干扰游离巯基含量较低的读数。因此，在本研究中，采用412 nm的波长。
由于DNTB的性质，在412 nm处观察到背景吸光度。因此，所有测量都使用了基线校正。对于SoloVPE仪器，以Abs/mm（斜率）为单位记录为测量的原始数据，而不是传统紫外-可见分光光度计中的Abs/cm。为了防止SoloVPE的斜率（Abs/mm）与常规紫外-可见仪器校准标准曲线的斜率混淆，将SoloVPE的斜率（Abs/mm）乘以10，即1 cm等于10 mm，换算成Au（Abs/cm），用下式表示。
这里使用Ellman试剂（DTNB）与游离巯基反应，所得化合物在412 nm处有吸收，预先确定的消光系数为13700（变性条件）（M−1•cm−1）。应用消光系数和朗伯-比尔定律测定了变性条件下含单抗蛋白的游离巯基含量。朗伯-比尔定律用以下方程式表示，以获得游离巯基浓度：
自由巯基与单抗的摩尔摩尔比计算如下公式：
结论
本文报道了一种新的游离巯基测定方法，该方法可适用于单抗等蛋白类物质。Ellman试剂，在室温下存放4小时，以及在2-8◦C下存放18小时，都是稳定的。该方法稳健、准确、高效。在pH=8时，测得的游离巯基的消光系数为13700(M−1•cm−1)，然后该消光系数用于测试未知样品浓度，包括原液样品和过程样品，不需要测定校准曲线。两年的0.6 mol BSA的趋势数据显示，中间精度的RSD为5%。该方法用LOQ为0.1 mol：mol的单抗。
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