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使用SoloVPE可变光程技术测定蛋白质的摩尔消光系数

浏览: 时间:2024-04-17

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介绍

本文节选自University of Wisconsin生物化学系Darrell R. McCaslin的应用简报。

光谱法有多种形式,它是生物分子结构和功能表征的重要工具。吸收光谱法是最简单也是最为人所熟悉的,它可通过直接和间接方法对生物分子进行定量。其中,间接分析方法是很常见的,它利用各种化学反应来提供可通过光谱定量的信号。这些方法通常需要构建标准曲线,而且标准物质的化学反应要准确对应目标分子的数量。如果目标分子的消光系数已知,那么通过吸光度的读数直接得出浓度,无需使用任何标准物质。这篇应用简报里,作者描述了使用SoloVPE可变光程技术和斜率光谱法,测定含有色氨酸和酪氨酸的蛋白质摩尔消光系数的方法


SoloVPE简介

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SoloVPE与Cary60分光光度计配合使用。Cary60从传输光缆的一端提供光源,传输光缆的另一端连接到SoloVPE中的光纤平台。在平台上,光被传送到“小光纤”(Fibrette)的一端,小光纤通过光纤耦合器连接到光纤平台,光纤的另一端浸入位于光纤平台下方的比色皿中的样品溶液里。从这个浸没的光纤端面射出的光,通过样品进入比色皿下方的检测器。

SoloVPE的光程L是小光纤浸没的端面到比色皿内表面底部的距离。浸没深度由光纤平台的位置控制,光纤平台通过光纤耦合器连接到光纤平台上。光纤平台的垂直位置由软件驱动的步进马达决定;从而在样品中可以精确改变光纤端面的位置。
光谱法定量的理论基础是朗勃比尔定律:
Beer‘s Law   A = e L c 

式中,A是溶液的吸光度,L是光程,c是溶液浓度,e是样品分子的本身特性,即摩尔消光系数,其单位是c和L乘积的倒数。公式中A对于c和L都是线性的,线性偏差可能是由于仪器本身或溶液中分子性质随c的增加而发生变化导致的。SoloVPE允许使用单个样品在多个光程下快速测量完整光谱;从中我们可以构建一个吸光度与光程长度的“斜线”。剖面图中的斜率(m)为e*c,因此可以通过其中一个对另一个进行计算:

m = d(A)/d(L) = e c

斜率法测量提供了在单个光程上不能获得的更多信息,提高了结果的精度。此外如果浓度在仪器的比尔定律线性区域内(对于单抗药物,范围0.05-300 mg/mL),还可以省去稀释步骤。


浓度与斜率的关系
如果缓冲液的吸光度随着光程的变化,没有显著函数变化,那么可以不需要进行背景校正,测量的缓冲液吸光度将被仪器基线抵消。下图右显示的是从基线校正和未校正的光谱剖面图中提取的。可以看到,截距大小与两组的浓度无关。这表明在这种情况下不需要做缓冲液背景校正,即缓冲液没有显著的依赖于光程的吸光度。

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SoloVPE测定蛋白质的摩尔消光系数
对于浓度的定量,摩尔消光系数必须是已知的。如果样品可以被准确称重,就可以使用斜率光谱法测量摩尔消光系数。对于大多数生物制品来说,干重不容易测量。对于蛋白质而言,在280 nm处对吸光度起主要作用的是色氨酸(W)和酪氨酸(Y)残基,以及二硫键(CC)的贡献。一般来说,我们会知道蛋白质的完整序列,尽管二硫键模式也许不能被完全表征,但是我们对每个多肽链的吸光度的主要影响因素有一个准确的评估。此外,大多数蛋白质在6 mol/L盐酸胍(GuHCI)中完全变性,因此可以近似消除蛋白质折叠产生的影响。Edelhoch("Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins", Biochemistry 6: 1948-1954)开发了一种方法,通过测定6 mol/L GuHCI溶液中蛋白质的W、Y和CC的含量来计算蛋白质的摩尔消光系数。在这里,这种方法与SoloVPE的斜率光谱法相结合,对于给定的一种蛋白质溶液,稀释到相同体积的缓冲液或盐酸胍溶液中,在两种溶液中测得的斜率之比就是它们的摩尔消光系数之比:


mwater/mGuHCI ewater[P]/eGuHCI[P] =  ewater/eGuHCI

以BSA为例,W=2,Y=20,CC=17,根据Pace, C. N., et al. (1995). "How to measure and predict the molar extinction coefficient of a protein." Protein Science 4: 2411-2423文章中的推导公式,计算在6 mol/L GuHCL中蛋白质的摩尔消光系数eGuHCI = W*5685+Y*1285+CC*125。如果准确地将样品稀释成GuHCI溶液,并确定剖面图的斜率,则该摩尔消光系数可用于计算浓度。本研究中使用的商业材料的报告浓度为275 mg/mL。使用280 nm截面图的斜率,将50 uL的样品稀释到5.05 mL,并计算在6 mol/L GuHCL中蛋白质的摩尔消光系数e(GuHCL)(3.9 x 104/M/cm,见下表),计算出浓度值为299 mg/mL,浓度高了约8%。


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在计算了eGuHCI并测量了蛋白质在水中和6 mol/L GuHCL中的斜率值,计算ewater就简单了。

mwater/mGuHCI eGuHCI =  ewater

SoloVPE在不同的光谱波长区域允许不同的光程长度增量。因此,可以在具有不同摩尔消光系数的波长范围内(例如近紫外区域和远紫外区域)一次性创建良好的斜率图。使用这种方法,只需一个样品就可以完成摩尔消光系数的测定。

m220/m280e280 = e220

结合精确的浓度测量,通过精确的称重,或蛋白质的氨基酸定量分析,SoloVPE还提供了一种简单、直接的方法来确定摩尔消光系数。上面描述的方法,是在未知浓度的情况下,测量出了蛋白质的摩尔消光系数。这些数据还可以用来构建完整的摩尔消光系数谱系。SoloVPE的可改变光程技术和斜率值提供了丰富的信息,与单点固定光程的测量相比,减少了误差。

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注:所有标志和商标均属其持有人所有,引用仅供说明之用。本产品与SoloVPE可变光程紫外生产厂商的耗材无任何关联。