使用SoloVPE可变光程技术测定蛋白质的摩尔消光系数

浏览：2343 时间：2024-04-17

介绍

本文节选自University of Wisconsin生物化学系Darrell R. McCaslin的应用简报。

法有多种形式，它是生物分子结构和功能表征的重要工具。吸收光谱法是最简单也是最为人所熟悉的，它可通过直接和间接方法对生物分子进行定量。其中，间接分析方法是很常见的，它利用各种化学反应来提供可通过光谱定量的信号。这些方法通常需要构建标准曲线，而且标准物质的化学反应要准确对应目标分子的数量。如果目标分子的消光系数已知，那么通过吸光度的读数直接得出浓度，无需使用任何标准物质。这篇应用简报里，作者描述了使用可变技术和光谱法，测定含有色氨酸和酪氨酸的蛋白质摩尔消光系数的方法。

SoloVPE简介

640

SoloVPE与Cary60分光光度计配合使用。Cary60从传输光缆的一端提供光源，传输光缆的另一端连接到SoloVPE中的光纤平台。在平台上，光被传送到“小光纤”（Fibrette）的一端，小光纤通过光纤耦合器连接到光纤平台，光纤的另一端浸入位于光纤平台下方的比色皿中的溶液里。从这个浸没的光纤端面射出的光，通过样品进入比色皿下方的检测器。

SoloVPE的光程L是小光纤浸没的端面到比色皿内表面底部的距离。浸没深度由光纤平台的位置控制，光纤平台通过光纤耦合器连接到光纤平台上。光纤平台的垂直位置由软件驱动的步进马达决定；从而在样品中可以精确改变光纤端面的位置。

光谱法定量的理论基础是朗勃比尔定律：

Beer‘s Law A = e L c

式中，A是溶液的吸光度，L是光程，c是溶液浓度，e是样品分子的本身特性，即摩尔消光系数，其单位是c和L乘积的倒数。公式中A对于c和L都是线性的，线性偏差可能是由于仪器本身或溶液中分子性质随c的增加而发生变化导致的。SoloVPE允许使用单个样品在多个光程下快速测量完整光谱；从中我们可以构建一个吸光度与光程长度的“斜线”。剖面图中的斜率（m）为e*c，因此可以通过其中一个对另一个进行计算：

m = d(A)/d(L) = e c

斜率法测量提供了在单个光程上不能获得的更多信息，提高了结果的精度。此外如果浓度在仪器的比尔定律线性区域内（对于单抗药物，范围0.05-300 mg/mL），还可以省去稀释步骤。

浓度与斜率的关系

如果缓冲液的吸光度随着光程的变化，没有显著函数变化，那么可以不需要进行背景校正，测量的缓冲液吸光度将被仪器基线抵消。下图右显示的是从基线校正和未校正的光谱剖面图中提取的。可以看到，截距大小与两组的浓度无关。这表明在这种情况下不需要做缓冲液背景校正，即缓冲液没有显著的依赖于光程的吸光度。

640 (1)

SoloVPE测定蛋白质的摩尔消光系数

对于浓度的定量，摩尔消光系数必须是已知的。如果样品可以被准确称重，就可以使用斜率光谱法测量摩尔消光系数。对于大多数生物制品来说，干重不容易测量。对于蛋白质而言，在280 nm处对吸光度起主要作用的是色氨酸（W）和酪氨酸（Y）残基，以及二硫键（CC）的贡献。一般来说，我们会知道蛋白质的完整序列，尽管二硫键模式也许不能被完全表征，但是我们对每个多肽链的吸光度的主要影响因素有一个准确的评估。此外，大多数蛋白质在6 mol/L盐酸胍（GuHCI）中完全变性，因此可以近似消除蛋白质折叠产生的影响。Edelhoch（"Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins", Biochemistry 6: 1948-1954）开发了一种方法，通过测定6 mol/L GuHCI溶液中蛋白质的W、Y和CC的含量来计算蛋白质的摩尔消光系数。在这里，这种方法与SoloVPE的斜率光谱法相结合，对于给定的一种蛋白质溶液，稀释到相同体积的缓冲液或盐酸胍溶液中，在两种溶液中测得的斜率之比就是它们的摩尔消光系数之比：

^m_water/^m_GuHCI = ^e_water^[P]/e_{_GuHCI}^[P] = ^e_water/^e_GuHCI

以BSA为例，W=2，Y=20，CC=17，根据Pace, C. N., et al. (1995). "How to measure and predict the molar extinction coefficient of a protein." Protein Science 4: 2411-2423文章中的推导公式，计算在6 mol/L GuHCL中蛋白质的摩尔消光系数e_GuHCI = W*5685+Y*1285+CC*125。如果准确地将样品稀释成GuHCI溶液，并确定剖面图的斜率，则该摩尔消光系数可用于计算浓度。本研究中使用的商业材料的报告浓度为275 mg/mL。使用280 nm截面图的斜率，将50 uL的样品稀释到5.05 mL，并计算在6 mol/L GuHCL中蛋白质的摩尔消光系数e(GuHCL)（3.9 x 104/M/cm，见下表），计算出浓度值为299 mg/mL，浓度高了约8%。

640 (2)

640 (3)

在计算了e_GuHCI并测量了蛋白质在水中和6 mol/L GuHCL中的斜率值，计算e_water就简单了。

^m_water/^m_GuHCI ^e_{_GuHCI}= ^e_water

SoloVPE在不同的光谱波长区域允许不同的光程长度增量。因此，可以在具有不同摩尔消光系数的波长范围内（例如近紫外区域和远紫外区域）一次性创建良好的斜率图。使用这种方法，只需一个样品就可以完成摩尔消光系数的测定。

^m₂₂₀/^m₂₈₀^e₂₈₀ = ^e₂₂₀

结合精确的浓度测量，通过精确的称重，或蛋白质的氨基酸定量分析，SoloVPE还提供了一种简单、直接的方法来确定摩尔消光系数。上面描述的方法，是在未知浓度的情况下，测量出了蛋白质的摩尔消光系数。这些数据还可以用来构建完整的摩尔消光系数谱系。SoloVPE的可改变光程技术和斜率值提供了丰富的信息，与单点固定光程的测量相比，减少了误差。

640 (4)